Tuotteet

Tapa, jolla samanaikaisten mutaatioiden vaikutukset yhdistyvät muuttamaan entsymaattista aktiivisuutta, ei ole helposti ennustettavissa, koska nämä vaikutukset eivät aina ole additiivisia lineaarisesti.Näin ollen substraattia sitovien aminohappotähteiden samanaikaisten mutaatioiden vaikutusten karakterisointi voi edistää merkittävästi entsyymien substraattispesifisyyden ymmärtämistä.Spodoptera frugiperdan (Sfbetagly) beeta-glykosidaasissa molemmat tähteet Q39 ja E451 ovat vuorovaikutuksessa substraatin kanssa, ja tämä on välttämätöntä substraattispesifisyyden määrittämiseksi.Sfbetaglyn kaksoismutantit (A451E39, S451E39 ja S451N39) valmistettiin kohdennetulla mutageneesillä, ekspressoitiin bakteereissa ja puhdistettiin käyttämällä affiniteettikromatografiaa.Nämä entsyymit karakterisoitiin käyttämällä p-nitrofenyyli-beeta-galaktosidia ja p-nitrofenyyli-beeta-fukosidia substraatteina.K cat/Km -suhdetta Sfbetaglyn yksittäisille ja kaksoismutanteille, jotka sisältävät kohdistettuja mutaatioita kohdissa Q39 ja E451, käytettiin osoittamaan, että kaksoismutaatioiden (Gdouble) vaikutus ESdouble tikarin (entsyymi-siirtymätilakompleksi) vapaaseen energiaan daggerxy) ei ole yksittäisten mutaatioiden (Gdouble daggerx ja Gdouble daggery) aiheuttamien vaikutusten summa.Tämä ero Gdouble Daggerissa osoittaa, että yksittäisten mutaatioiden vaikutukset menevät osittain päällekkäin.Näin ollen tämä yleinen vaikutus lasketaan vain kerran Gdouble daggerxy:ssä.Beeta-glykosidaasien kidetiedot paljastavat kaksihampaisen vetysidoksen, joka sisältää tähteet Q39 ja E451 ja saman substraatin hydroksyyliryhmän.Siksi sekä termodynaamiset että kristallografiset tiedot viittaavat siihen, että tähteillä Q39 ja E451 on keskinäinen vaikutus niiden vastaaviin vuorovaikutuksiin substraatin kanssa.