Tuotteet

Proteominlaajuisten fosforylaatiotapahtumien analysointi on edelleen suuri analyyttinen haaste proteiinien fosforylaatioverkkojen valtavan monimutkaisuuden vuoksi.Tässä työssä arvioimme Lys-N:n, Lys-C:n ja trypsiinin täydentävyyttä suhteessa niiden kykyyn osallistua fosfoproteomin globaaliin analyysiin.Jalostettua versiota matalan pH:n vahvasta kationinvaihdosta käytettiin N-terminaalisesti asetyloitujen, fosforyloitujen ja modifioimattomien peptidien erottamiseen tehokkaasti.Yhteensä 5036 ei-redundanttia fosfopeptidiä voitiin identifioida <1 %:n väärillä löydöksillä 1 mg:sta proteiinia käyttämällä näiden kolmen entsyymin yhdistelmää.Tietomme paljastivat, että päällekkäisyys eri proteaaseilla luotujen fosfopeptiditietosarjojen välillä oli marginaalinen, kun taas kahden samalla tavalla generoidun tryptisen tietojoukon päällekkäisyyden havaittiin olevan vähintään 4 kertaa suurempi.Tällä tavalla Lys-N:n ja trypsiinin rinnakkaiskäyttö mahdollisti 72 %:n lisäyksen havaittujen fosfopeptidien lukumäärässä verrattuna d:hen pelkkään trypsiiniin, kun taas trypsiinin rinnakkaiskoe johti vain 25 %:n kasvuun.Siten, kun keskityimme vain trypsiini- ja Lys-N-tietoihin, tunnistimme 4671 ei-redundanttia fosfopeptidiä.Havaittujen kohtien lisäanalyysi osoitti, että Lys-N- ja trypsiinitietojoukot rikastuivat merkittävästi erilaisilla fosforylaatiomotiiveilla, mikä edelleen osoittaa, että multiproteaasilähestymistavat ovat erittäin arvokkaita fosfoproteomianalyyseissä.