Tuotteet

Uusi korkean suorituskyvyn nestekromatografinen määritys glykosyylitransferaaseille, joka perustuu derivatisointiin antraniilihapolla ja fluoresenssin havaitsemiseen.

Määritykset kehitettiin käyttämällä ainutlaatuista 2-aminobentsoehapon (2AA; antraniilihappo, AA) leimauskemiaa sekä β1-4-galaktosyylitransferaasin (GalT-1) että α2-6-sialyylitransferaasin (ST-6) aktiivisuuden mittaamiseksi korkean suorituskyvyn nesteellä. kromatografia (HPLC) fluoresenssidetektiolla (Anumula KR. 2006. Edistyneitä fluoresenssijohdannaismenetelmiä glykoproteiinihiilihydraattien korkean suorituskyvyn nestekromatografiseen analyysiin. Anal Biochem. 350:1-23).N-asetyyliglukosamiinia (GlcNAc) ja N-asetyylilaktosamiinia käytettiin vastaanottajina ja uridiinidifosfaatti- (UDP)-galaktoosia ja sytidiinimonofosfaattia (CMP)-N-asetyylineuramiinihappoa (NANA) luovuttajina GalT-1:lle ja ST-6:lle, vastaavasti.Entsymaattiset tuotteet leimattiin in situ AA:lla ja erotettiin substraateista TSKgel Amide 80 -kolonnissa käyttäen normaalifaasiolosuhteita.Entsyymiyksiköt määritettiin piikkien alueilta vertaamalla samanaikaisesti derivatisoituihin standardeihin Gal-β1-4GlcNAc ja NANA-a2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Lineaarisuus (aika ja entsyymipitoisuus), tarkkuus (sisäinen ja interanalyysi) ja toistettavuus määritettiin.Määritysten havaittiin olevan käyttökelpoisia entsyymiaktiivisuuksien seurannassa eristyksen ja puhdistuksen aikana.Määritykset olivat erittäin herkkiä ja suoriutuivat yhtä hyvin tai paremmin kuin perinteiset radioaktiiviseen sokeriin perustuvat mittaukset.Määritysformaattia voidaan käyttää myös muiden transferaasien aktiivisuuden mittaamiseen edellyttäen, että hiilihydraattiakseptorit sisältävät pelkistävän pään leimaamista varten.Testi glykoproteiinin vastaanottajille kehitettiin käyttämällä IgG:tä.IgG-glykaanien (kaksiantenni G0, G1, G2, mono- ja disialyloitu) erottamiseen kehitettiin lyhyt HPLC-profilointimenetelmä, joka helpotti GalT-1- ja ST-6-aktiivisuuksien määrittämistä nopeasti.Lisäksi tämän profilointimenetelmän pitäisi osoittautua hyödylliseksi IgG-glykaanien muutosten seurannassa kliinisissä olosuhteissa.