Tuotteet

Proteiinin fosforylaatio säätelee erilaisia ​​solutoimintoja ja sillä on keskeinen rooli kasvien varhaisessa kehityksessä.Täydentääksemme ja laajentaaksemme aiempia proteiinien fosforylaatiotutkimuksia Arabidopsis-taimissa käytimme vaihtoehtoista lähestymistapaa, jossa proteiinien uuttaminen denaturoimattomissa olosuhteissa yhdistetään ehjien fosfoproteiinien immobilisoidun metalli-ioniaffiniteettikromatografian (IMAC) rikastamiseen Rubisco-puutteellisissa uutteissa, mitä seurasi tunnistus. käyttäen kaksiulotteista geelielektroforeesia (2-DE) ja nestekromatografia-tandem-massaspektrometriaa (LC-MS/MS).Geelissä tapahtuva trypsiinidigestio ja valittujen geelitäplien analyysi tunnisti 144 fosforyloitua peptidiä ja tähdettä, joista vain 18 fosfopeptidiä ja 8 fosfosiittia löydettiin PhosPhAt 4.0- ja P3DB Arabidopsis thaliana -fosforylaatiopaikkatietokannoista.Yli puolet 82 tunnistetusta fosfoproteiinista osallistui hiilihydraattiaineenvaihduntaan, fotosynteesiin/hengitykseen tai oksidatiiviseen stressireaktiomekanismiin.Intaktien fosfoproteiinien rikastaminen ennen 2-DE:tä ja LC-MS/MS:tä näyttää tehostavan fosforyloituneiden treoniini- ja tyrosiinitähteiden havaitsemista verrattuna menetelmiin, jotka käyttävät peptiditason rikastamista, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi lähestymistapaa ovat jossain määrin toisiaan täydentäviä fosforylaatiokohdan peittävyyden suhteen.Nuorten taimien tuloksia verrattaessa aiemmin kypsillä Arabidopsis-lehdillä saatuihin tuloksiin havaittiin viisi proteiinia, jotka fosforyloituvat näissä kudoksissa, mikä osoittaa tämän tekniikan mahdollisuudet tutkia proteiinien fosforylaation dynamiikkaa kasvien kehityksen aikana.